Seminarium powołano dekretem na synodzie diecezjalnym w 1601 roku, erygowano już w 1602 roku. Początkowo alumni mieszkali na Wawelu w seminarium zamkowym, w 1682 roku dekretem Kapituły Katedralnej oddano je księżom misjonarzom, choć nadal pozostało diecezjalnym. W latach 1720–1732 budynek znacznie powiększono. W 1732 roku powołano drugie seminarium na Stradomiu dla kandydatów do zgromadzenia i alumnów przygotowujących się do pracy, a w 1758 roku trzecie seminarium akademickie związane z Uniwersytetem. W 1801 roku władze austriackie zamknęły seminaria akademickie i zamkowe, które wcielono do seminarium księży misjonarzy na Stradomiu.

W 1901 roku powstało seminarium przy ulicy Podzamcze. Neogotycki gmach wzniesiono w latach 1899–1902 staraniem kardynała Jana Puzyny, według projektu Gabriela Niewiadomskiego. W czasie pierwszej wojny światowej do 1918 roku mieścił się tu szpital wojskowy, potem do 1920 roku sztab wojsk generała Hallera i amerykański Czerwony Krzyż. W latach 1926–1928 gmach powiększono.

W 1939 roku budynek zajęli Niemców. Seminarium do 1941 roku funkcjonowało w Domu Katolickim, dzisiejszej Filharmonii Krakowskiej, później arcybiskup Adam Sapieha zorganizował tajne seminarium, a klerycy mieszkali przy parafiach i spotykali się w pałacu biskupim.

Jednym z alumnów seminarium w 1945 roku był Karol Wojtyła. Lata 70. i 80. XX wieku seminarium remontowano i rozbudowywano z inicjatywy kardynała Karola Wojtyły i kardynała Franciszka Macharskiego. W 1991 roku gościło w nim Ojca Świętego Jana Pawła II. Po wielu remontach i modernizacjach w kolejnych latach, w 2001 roku świętowano 400-lecie seminarium.

Od 2021 kandydaci przygotowujący się do kapłaństwa z archidiecezji krakowskiej i diecezji bielsko-żywieckiej, nie rozpoczynają najpierw studiów, przechodzą tak zwany okres propedeutyczny, jest on przeznaczony na czytanie Pisma Świętego, osobistą modlitwę, pracę i zastanowienie się nad swoim powołaniem. Okres ten trwał jeden rok i przeżywany był przez dwa lata na terenie ośrodka "Totus Tuus im. kard. Karola Wojtyły" w Zembrzycach w powiecie suskim. Od października 2023 najmłodsi kandydaci do kapłaństwa mieszkają tam tylko przez pierwszy miesiąc, następnie przenoszą się do krakowskiej siedziby seminarium na Podzamczu. Wprowadzenie tego okresu  spowodowało wydłużenie przygotowania do kapłaństwa w dwóch diecezjach z sześciu do siedmiu lat.