To najstarsze Muzeum Diecezjalne w Polsce. Mieści się w trzech kamieniczkach, które znajdują się obok katedry. Cenną częścią kolekcji są zabytki sztuki cechowej - gotyckiej rzeźby i malarstwa z terenu Małopolski. Kolejne zbiory to kolekcja ornatów i innych tkanin kościelnych, pochodzących nawet ze średniowiecza oraz zbiór porcelany i zegarów. Zaskakuje dobra kolekcja polskiego malarstwa przełomu wieków XIX i XX wieku, między innymi Wojciecha Weissa, Vlastimila Hofmana, Kazimierza Sichulskiego oraz Jacka Malczewskiego. Duży dział obejmuje sztukę ludową, przede wszystkim malarstwo na szkle, nie tylko z Polski, ale i z wielu krajów europejskich. W 2019 roku - ogłoszonym jubileuszowym na pamiątkę setnej rocznicy urodzin św. Jana Pawła II - tarnowski kolekcjoner Bronisław Usarz przekazał do Muzeum zbiór złotych i srebrnych numizmatów z różnych światowych mennic oraz medali, które stanowią doskonałą artystyczną dokumentację ważniejszych wydarzeń historycznych oraz ilustrują wyjątkowy pontyfikat papieża Polaka. Muzeum w 2023 roku obchodzi 135 rocznicę powstania.